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多肽類普及知識

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多肽類普及知識

發布日期:2019-05-25 作者:上海快3形状态走势一定牛 點擊:

1.多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間産物,合成過程可以連續進行,進而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成,基本都是固相合成。其基本過程如下:

基于Fmoc化學合成,先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連,然後以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點,同其它的氨基酸已經活化的羧基作用形成肽鍵,不斷重複這一過程,即可得到多肽。根據多肽的氨基酸組成不同,多肽後處理方式不同,純化方式也有差異。

2.多肽狀态是如何?如何保存儲存?

我們提供的多肽是粉末狀,一般為灰白色,組成不同,多肽粉末的顔色有差異,多肽一般長期保存需要避光保存,并應保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短時間的話是以室溫運輸。

3.如何溶解多肽?

因為多肽溶解比較複雜,通常是先取一點試驗,在沒有确定合适的溶劑前請勿全部溶解。

下列為選擇溶解溶劑的一般方法:

(1)判定多肽的電荷特定,設定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1;堿性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其它氨基酸的電荷為0。計算出淨電荷數。

(2)如果淨電荷數 >0,多肽為堿性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽還不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然後加入500ul水稀釋。

(3)如果淨電荷數<0,多肽為酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然後加入500ul水稀釋。

(4)如果淨電荷數=0,多肽為中性,一般需要用有機溶劑如乙腈,甲醇或異丙醇,DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。

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4.非HPLC純化的多肽和經過HPLC純化的多肽有何區别?

粗品和脫鹽級别的多肽中雜質為多肽和非多肽類:如非全長多肽和多肽後處理的一些原料如DTT、TFA等;而經過HPLC純化的多肽,仍會有一些雜質存在,其中的雜質主要是短肽和微量TFA。

5.多長的多肽為合适?

多肽合成需要考慮多肽的長度,電荷,親疏水性等因素。長度越長,合成粗品的純度和産率都随着降低,純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當然多肽功能區的序列是無法改變的,但是為了多肽的順利合成,有時不得不在功能區的上下遊增加一些輔助氨基酸,以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短,合成也可能有問題,主要問題是合成的多肽在後處理過程中有一定的難度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否則後處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的産率和得率。
6.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽很難溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成,都有可能有問題。

(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%,不能連續5個連續aa為疏水性,帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負電荷D,E,C- terminus)的比例達到20%,在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸,也可以改善溶解性。

7.為什麼含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?

含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成,同時難以獲得高純度的産品。主要因為這些基團不穩定,易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特别注意,避免反複開啟蓋子。

8.為什麼有些多肽的合成産率或純度會比較低?

多肽合成與引子合成有比較大的區别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽經常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重複時,多肽鍊在合成過程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下幾種情形,合成效率和産物的純度都比較低,如:重複Pro,Ser-Ser,重複Asp,4個連續Gly等.

9.多肽是如何純化的?

多肽純化一般使用反相柱(如C8,C18等),214nm。緩沖體系通常為含TFA的溶劑,pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O,Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解後,然後用Buffer A稀釋;對疏水性強的多肽,有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗産物,如果多肽不長(15aa以下),一般會有主峰,主峰通常為全長産物;對于20aa以上的長肽,如果沒有主峰,HPLC需搭配Mass來判定分子量,進而确定哪個峰是所要合成的多肽.

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